技术在高级类器官模型中的作用：从静态到动态
什么是类器官模型？
类器官是由干细胞衍生而来的微小三维（3D）多细胞结构，它们能够自我组装成微型化、简化的器官雏形。类器官建模模拟了器官发育、结构和功能的关键特征。与传统的细胞培养相比，类器官再现了器官特异性的细胞异质性、空间排布和功能输出，使其成为研究疾病机制、宿主-病原体相互作用以及精准医疗的强大工具。
目前，类器官技术已成功应用于多种组织和器官，包括大脑、视网膜、肝脏、肺、肠道、肾脏、胰腺以及各类肿瘤。每种类器官都展现出特定的类组织特征。例如，肠道类器官可以形成隐窝-绒毛结构，视网膜类器官能发育出分层的光感受器阵列，而肾脏类器官则能生成类似肾单位的肾小管。在获取人类或动物组织受限或面临伦理困境的领域，这些模型为深入理解人体生物学提供了宝贵的视角。
尽管具有极高的生物学保真度，传统的静态类器官培养仍存在一定局限性。它们通常被包埋在细胞外基质（ECM）凝胶（如Matrigel基质胶）中或以悬浮状态生长。这会限制营养物质和氧气的扩散，导致体积较大的类器官内部形成坏死核心。这种扩散屏障限制了类器官的尺寸、存活时间以及细胞的成熟度。此外，静态系统无法重现动态的物理信号，例如对细胞成熟和分化至关重要的灌注流体剪切力。这些缺陷阻碍了血管化组织和复杂器官级功能的建模，从而降低了该系统在药物筛选或疾病建模中的临床转化价值。
基础原理：当微流控遇上类器官
微流控技术通过在层流条件下对微尺度流体进行精准操控，克服了上述障碍。该系统能够对细胞微环境进行高度控制，从而可重复地实现营养物质和氧气的连续灌注、机械力刺激的施加以及生化梯度的建立。因此，微流控平台有效提高了类器官的存活率，促进了组织的成熟，并支持了血管化的形成。
借助微小体积流体的操作优势，微流控技术能够实现实时监测、梯度生成以及药物和信号分子的精准递送。在微流控芯片中，研究人员可以达到单类器官级别的分辨率并进行高通量筛选，提供了出色的扩展性和实验控制力。
目前在类器官研究中常用的微流控模式包括：
闭式通道系统：通过可灌注的通道模拟血管网络。图1展示了如何对连接进出口的中间通道内的类器官进行灌注，同时在相邻通道中加载包埋在水凝胶中的内皮细胞和成纤维细胞，以促进肿瘤类器官的血管化。(1)
图1：微流控设备与器官芯片。对肿瘤类器官培养物进行血管网络灌注，以模拟血管生成。
- 开放式微流控：便于直接接触组织进行分析。如图2所示，一种3D打印的微流控设备被设计用于培养早期神经类器官，允许来自周围通道（接种了hPSC衍生的血管细胞）的血管长入类器官中。这种结构可以密封进行灌注培养，随后开启以方便进行流式细胞术和蛋白质组学等后续分析。(2)
图2：(A) 芯片上类器官的体视显微镜图像。比例尺：2mm。(B) 芯片上血管生成的示意图
- 液滴与微珠微流控：将细胞包裹在均匀的液滴中，以实现类器官的快速生成。图3展示了利用微珠胶囊进行细胞分子分析和高通量操作。(3)
图3：微珠操作及研究的方法学进展。
从静态向动态过渡：技术实现路径
静态条件下培养类器官有哪些局限性？
静态类器官培养的尺寸受到扩散屏障的限制。扩散屏障是指氧气、营养物质和代谢产物能够有效扩散进入3D组织结构（如类器官）以支持细胞存活和功能的最大距离。超过这一临界距离，细胞就会经历缺氧或营养匮乏，从而导致坏死核心的形成。通常，直径大于300-500µm的类器官就会出现坏死核心，这在Matrigel基质胶圆顶滴定（Domes）和悬浮培养等静态系统中尤为突出。此外，缺乏血管网络和机械力刺激的类器官也无法实现生理成熟和功能复杂化。
表1. 类器官与3D组织培养中的扩散极限
| 分子 | 在3D组织中的近似扩散极限 | 生物学影响 | 参考文献 |
|---|---|---|---|
| 氧气 (O₂) | ~100–200 μm | 超过该极限将导致缺氧和细胞死亡 | (4) |
| 营养物质（如葡萄糖） | ~200–400 μm | 能量短缺，细胞增殖受损 | (5) |
| 代谢废物清除 | ~200–400 μm | 有毒副产物的积累会损害细胞功能 | (5) |
1. 类器官模型的灌注与血管化
基于灌注的微流控平台打破了静态系统的局限，推动了类器官培养的发展。通过提供连续、受控的流体流动，这些平台可用于诱导血管化，在增强营养和氧气递送的同时，施加有助于组织成熟的剪切应力。
一个典型的案例是，肾脏类器官的灌注显著增强了其血管化程度和组织发育水平。在受控的高流体剪切应力（1-4.27 mL/min）下，肾脏类器官的血管面积（PECAM1转录本）增加了5倍，血管分支增加了10倍，内皮基因的表达水平也显著提升。这些结果远远超越了静态条件下的培养效果（图4）。在该模型中，类器官被固定在通道内，并在闭式通道中进行灌注(6)。
图4：在静态、低流体剪切力和高流体剪切力条件下，整体类器官培养物中血管标志物的共聚焦3D图像。比例尺 = 100µm。
另一种实现类器官血管化的方法是在芯片内嵌入可灌注的组件。在一个血管化的肾脏类器官芯片模型中，研究人员为内皮细胞和类器官分隔设计了独立的通道。这种构型允许内皮细胞与类器官自身的血管形成功能性连接，从而实现分子交换、细胞迁移和结构整合(7)。
更广泛的文献回顾证实，血管化是类器官突破数百微米尺寸限制并达到高级发育阶段的必要条件。没有血管网络的支持，扩散限制将导致中心坏死、细胞多样性受限以及组织结构不成熟(8)。同样，近期的研究也强调了“器官芯片上的类器官”（OOCoid）系统的发展。该系统结合了可灌注的血管网络和流体力学刺激，为肺、大脑、肾脏和肿瘤等多种模型的长期存活和生理功能提供了强有力的支持(9)。
图5：(A) DAPI-MCAM-PECAM共染色的免疫荧光图像，展示了在Transwell小室和芯片上培养的肾脏类器官，比例尺 = 200 µm。(B) 基于总面积百分比的肾脏类器官中MCAM和PECAM表达的统计学分析。
2. 用于成熟与分化的动态类器官培养
剪切应力、流体静压和循环张力等机械信号已被公认为类器官发育和功能的调节因子。细胞通过机械传导通路感知并响应这些机械力，进而影响基因表达和组织构建(10)。机械传导中一个已被充分研究的方面是细胞与周围细胞外基质（ECM）物理特性的相互作用，包括基质硬度和粘附配体的存在——这两者都对干细胞的命运和谱系分化具有直接影响。
然而，由于生物源性ECM（如Matrigel基质胶）存在批次间差异，其蛋白质组成和机械硬度都会受到影响，这使得这些特性的标准化仍然面临挑战。这种变异性增加了类器官研究在可重复性和规模化方面的难度(11)。
除了基质本身，培养环境施加的机械应力（尤其是灌注的模式和参数）也是决定类器官成熟的关键因素。与轨道式摇床培养相比，在连续、受控的层流下培养的中脑类器官，表现出向多巴胺能神经元分化的能力增强，并且坏死核心的形成显著减少(12)。这表明，动态的机械环境对于构建具有高度生理相关性的类器官模型是必不可少的。
图6：Hoechst细胞核染色（白色），展示了来源于三种不同野生型神经上皮干细胞（WT NESC）系的代表性人类中脑类器官（hMO）切片，在摇床或流体条件下培养的结果。黄色虚线标示了“死核区”（比例尺 = 200 μm）。
3. 用于高通量均质培养的类器官包裹技术
采用基于压力控制系统的液滴微流控技术，能够将细胞包裹进均一的纳升级液滴中。该系统可用于大规模生产类器官单元，这对于对比研究和药物筛选至关重要。例如，基于微珠的液滴平台允许将细胞外基质成分直接包裹在液滴内，从而有效提升3D培养的保真度并加强细胞-基质间的相互作用(13)。
图7：(a) 人间充质干细胞（hMSC）细胞球包裹在复乳液滴中6小时后的相差图像。(b) 6小时后使用1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇从乳液中释放出来的细胞球的活/死染色图像。活细胞用Calcein AM标记（绿色），死细胞用PI标记（红色）。(13)
总结与未来展望
将受控的流体技术引入类器官研究，标志着克服静态3D培养长期局限性的一项关键进展。传统的类器官系统受制于扩散屏障，这不仅导致生化微环境难以控制，还缺乏必要的生物力学信号。两者均阻碍了组织的成熟以及模型规模化的进程。
当闭式通道微流控平台、基于液滴的包裹系统以及微珠工作流程与精准的流量控制相结合时，研究人员便能够实现对环境的严密控制以及对机械力的精细调节。这些特性对于模拟复杂的器官发育、诱导血管化以及引导特定区域的细胞命运走向具有决定性意义。如今已有充分证据表明，剪切应力和流体压力等机械刺激能够显著影响类器官的结构、存活率和功能分化，这在大脑、肾脏和血管模型中尤为明显。
展望未来，该领域的发展方向将聚焦于在微流控系统中整合更多维度的动态参数（如时空信号梯度），以进一步在体外高逼真度地模拟体内器官的发生过程。
器官芯片系统与实时生物传感器以及用于多器官互连的模块化平台（即人体芯片，Body-on-chip）的深度结合，有望全面提升类器官在疾病建模、新药发现和精准医疗领域的转化潜力。与此同时，在临床和工业应用中，持续致力于ECM材料的标准化和液滴微流控的自动化，将是确保技术可重复性和可扩展性的核心关键。
如需了解更多信息或进行技术交流.
相关产品与专家页
References
1. Gunti S, Hoke ATK, Vu KP, London NR. Organoid and Spheroid Tumor Models: Techniques and Applications. Cancers. 2021 Jan;13(4):874.
2. Salmon I, Grebenyuk S, Fattah ARA, Rustandi G, Pilkington T, Verfaillie C, et al. Engineering neurovascular organoids with 3D printed microfluidic chips. Lab Chip. 2022;22(8):1615–29.
3. Laperrousaz B, Porte S, Gerbaud S, Härmä V, Kermarrec F, Hourtane V, et al. Direct transfection of clonal organoids in Matrigel microbeads: a promising approach toward organoid-based genetic screens. Nucleic Acids Res. 2018 July 6;46(12):e70.
4. Ziółkowska-Suchanek I. Mimicking Tumor Hypoxia in Non-Small Cell Lung Cancer Employing Three-Dimensional In Vitro Models. Cells. 2021 Jan;10(1):141.
5. Kim D, Kim W, Sharma H, Lee S, Park C, Park S, et al. Ultra-Tiny Gelatin Nanoparticles-Assisted 3D Stem Cell Spheroids for Engineering Tissue Regeneration. Adv Healthc Mater. n/a(n/a):2501882.
6. Homan KA, Gupta N, Kroll KT, Kolesky DB, Skylar-Scott M, Miyoshi T, et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nat Methods. 2019 Mar;16(3):255–62.
7. Bas-Cristóbal Menéndez A, Du Z, van den Bosch TPP, Othman A, Gaio N, Silvestri C, et al. Creating a kidney organoid-vasculature interaction model using a novel organ-on-chip system. Sci Rep. 2022 Nov 30;12(1):20699.
8. Zhang S, Wan Z, Kamm RD. Vascularized organoids on a chip: strategies for engineering organoids with functional vasculature. Lab Chip. 2021 Feb 9;21(3):473–88.
9. Wang X, Bijonowski BM, Kurniawan NA. Vascularizing Organoids to Promote Long-Term Organogenesis on a Chip. Organoids. 2023 Dec;2(4):239–55.
10. Morena F, Armentano I, Montanucci P, Argentati C, Fortunati E, Montesano S, et al. Design of a nanocomposite substrate inducing adult stem cell assembly and progression toward an Epiblast-like or Primitive Endoderm-like phenotype via mechanotransduction. Biomaterials. 2017 Nov 1;144:211–29.
11. Taghizadeh M, Taghizadeh A, Kim HS. Mechanobiological engineering strategies for organoid culture. APL Bioeng. 2025 July 18;9(3):031501.
12. Berger E, Magliaro C, Paczia N, Monzel AS, Antony P, Linster CL, et al. Millifluidic culture improves human midbrain organoid vitality and differentiation. Lab Chip. 2018 Oct 9;18(20):3172–83.
13. (PDF) One drop at a time: Toward droplet microfluidics as a versatile tool for single-cell analysis. ResearchGate [Internet]. [cited 2025 Aug 8]; Available from: https://www.researchgate.net/publication/278401605_One_drop_at_a_time_Toward_droplet_microfluidics_as_a_versatile_tool_for_single-cell_analysis